摘要：

   应用表面等离子共振(SPR)技术主要应用于生物分子的快速检测，也可扩展至水质、农药残留以及有毒气体等痕量物质检测。该技术具有前处理简单、无需标记、灵敏度高以及实时、连续监测动态反应过程等优点，是一种很有前景的环境污染监测技术。文章介绍了表面等离子共振检测技术的基本原理及应用领域，并对该技术发展趋势进行了展望。

关键词：表面等离子共振；生物检测；环境监测；展望

中图分类号：TN29  文献标识码：A  文章编号

1 概述

表面等离子共振(Surface plasmon resonance, SPR)是一种物理光学现象，当入射光子以临界角入射到两种不同折射率的介质界面（比如玻璃表面的金或银镀层）时，可引起金属层中自由电子的共振，谐振电子吸收了光子能量，反射光强在一定角度内显著衰减。其中，使反射光完全消失的入射角称为SPR角。SPR角随着表面折射率的变化而变化，而表面折射率的变化又与结合在金属表面的生物分子质量成正比。因此可以通过获取生物反应过程中SPR角的动态变化，得到生物分子之间相互作用的特异性信号。与传统的生物化学分析方法相比，表面等离子共振传感技术具有前处理简单、无需标记、灵敏度高以及实时、连续监测等特点，该技术也可扩展至有害重金属离子的监测，在环境监测领域有很好的应用前景。

SPR现象的发现最早可推溯至1902年Wood ^[1]的报道。1941年，Fano^[2]从理论上初步地解释了这一光学现象。直到1968年，Kretschmann等^[3]利用衰减全反射棱镜耦合方法，实现了光激发表面等离子波(Surface plasmon wave, SPW)，为SPR传感器的产业化奠定了基础。1982年，Nylander和Liedberg等^[4-5]成功研制出首个SPR气体计生物传感器，并将这一技术应用于气体检测和化学传感器领域。1990年，瑞典乌普萨拉的BIAcore AB公司开发出首台具有商业用途的SPR仪器^[6]。     

SPR仪器主要由SPR光学检测系统、传感器芯片和微射流卡盘等3个部分组成。以下给出了几家国外企业仪器及简单简介。

图1  瑞典BIAcore公司生产的SPR3000仪器

该仪器将表面等离子共振（SPR）与芯片技术结合，可进行生物分子间相互作用的分析，实现观察相互作用的整个过程。该仪器无需借助标记物进行分析，可测定包括各类小分子化合物、多肽、蛋白质、寡核苷酸及类脂、噬菌体、病毒和细胞间的相互作用。属于研究级别的高端仪器设备。

图2芬兰BioNavis 公司生产的两款SPR分析仪

KSV SPR 200分析仪检出限: 3×10 ^-6 of RI（3×10 ^-6每单位折射率），3pg/mm²（相当于普通蛋白3 pg/mm²的表面覆盖度）。

KSV SPR 220a分析仪检出限: 1×10 ^-6 of RI（1×10 ^-6每单位折射率），1pg/mm²（相当于普通蛋白1 pg/mm²的表面覆盖度）。

上述两款仪器已可用于环境有机物污染的快速辅助监测。

此外，美国、韩国、日本等也有不同型号的仪器设备，包括一些小型化的专用分析仪。

图3  美国德州仪器公司的小型化 spreeta spr模块

图4 韩国K-mac spr micro 便携式表面等离子体分析仪

该两款分析仪外尺寸分别为 45(w)× 140(d)× 130(h)和40(w)×150(d)×110(h)（单位：mm），适合野外携带检测使用。

我国中科院研究所^[7]也进行了该类技术研究，并有仪器设备在用。

图5 日本HORIBA公司生产的SPRi-Plex™表面等离子体共振成像系统

2 表面等离子体共振传感器技术

衡量SPR传感器的主要参数指标是灵敏度和分辨率。其中，灵敏度是SPR传感器共振参数的变化量与被测样品折射率的变化量之比，它与棱镜、金属膜材料有关，还受到入射光波长的影响。分辨率则是SPR传感器能够检测到的样品折射率最小变化量，它与灵敏度和共振峰的特征参数有关，还与光源和测量仪器的性能相关。此外，SPR传感器的灵敏度和分辨率受周围环境扰动(包括温度、振动、压力等物理因素)的影响。根据SPW（Surface plasmon wave）激励方式，SPR传感器可分为棱镜型结构、光栅型结构和光纤型结构三种，其示意图分别如图2(a)、(b)和(c)所示。

图6 (a)棱镜型SPR传感器结构；(b)光栅型SPR传感器结构；(c)光纤型SPR传感器结构

2.1 棱镜型表面等离子共振传感器

棱镜耦合SPR传感器的装置又可分为Kretschmann型^[3]和Otto型^[8]。其中，Kretschmann型装置是将厚度为几十纳米的金属薄膜直接覆盖在棱镜的底部，将分析层介质置于金属薄膜层下方，倏失波透过金属薄膜可在1/2界面处产生SPR（图6(a)所示）。若金属薄膜的厚度超过倏失波的有效深度，则倏失波在金属薄膜内发生很大的衰减，不能到达1/2界面；若金属薄膜的厚度过薄，又不能达到最佳的共振效果。目前，绝大多数的SPR仪器均采用Kretschmann装置。为了提高SPR仪器的灵敏度和分辨率，已有各种基于棱镜耦合的复合多层结构被设计和使用。Byun等^[9]利用电子束刻蚀的方法在金属膜表面加工出周期为200nm和500nm的纳米线结构，使其表面不仅能激励SPW，还能与局域表面等离子体(Local surface plasmon, LSP)相互耦合，因此与传统的金属膜-棱镜结构相比，其灵敏度分别提高了44%和31%。Chien等^[10]采用棱镜耦合双金属包覆波导结构，即在棱镜底面镀上一层薄的金属膜，再加工一层波导层，然后再镀上一层金属膜，这样可在波导层上下两边同时激励SPW，产生双共振峰，从而提高SPR传感器的测量精度和分辨率。

2.2光栅型表面等离子共振传感器

1984年，Tiefenthaler等^[11]首次提出以衍射光栅作为光波耦合元件制作SPR传感器，光栅型SPR传感器的原理结构如图2(b)所示，入射波照射到光栅表面时产生衍射，不同的衍射角对应着不同的衍射阶。当某一阶衍射波矢在界面方向的分量与SPW的波矢相等时，二者发生共振，产生SPR现象，此时对应的衍射阶光强度将发生大幅度下降，甚至消失，因此，光栅耦合结构的SPR传感器可以通过检测衍射光波的强度分布以获得SPR峰值曲线。科研人员们围绕衍射光栅作为光学耦合元件开展过一些相关的研究，包括1997年Nikitin等^[12]开发的具有肖特基结构的衍射光栅型SPR传感器。然而，在光栅的制作上具有一定的难度，远不及棱镜的制作简单；在应用上，当样品为有色溶液时，溶液对光波产生吸收作用，则极大地影响了光栅型SPR传感器的测量。

2.3 光纤型表面等离子共振传感器

由于棱镜耦合SPR仪器体积较大，不适于远程传感测量，为此，1992年Jorgenson等^[13]提出基于波长调制的光导纤维型SPR传感器，通过光纤纤芯取代棱镜耦合的结构，在单根多模光纤中部或者终端附近一小部分剥除包层，将纤芯裸露出来，再在纤芯外包裹金属膜层及敏感层。当一束经过P偏振片处理的宽带光耦合进入光纤后，将会发生色散，形成若干以不同全反射角传播的单色P偏振光，如图2(c)所示。当某一波长的光线满足激发SPR条件时，会在整个纤芯柱面激发SPR现象^[14]。

在对气体浓度进行检测时，由于受到光纤纤芯折射率和数值孔径的限制，只有入射角大于临界角而小于90˚的入射波才能激发SPW，因此光纤型SPR传感器的折射率测量范围一般在1.25~1.40之间，需要在金属膜表面修饰覆盖一层敏感层，以调节共振波长位置从而提高分辨率和灵敏度。其中，采用金属纳米颗粒修饰和离子束或电子束刻蚀加工的方法，可实现纳米量级的空间分辨率^[15]。与棱镜耦合方式相比，光纤型SPR传感器具有体积小、重量轻、响应快、易于系统集成以及可远程在线实时监测等优点，可用于野外环境污染探测，有着更为广阔的发展前景和经济价值。

3表面等离子体共振技术在环境监测中的应用研究

二十多年来，表面等离子共振应用技术已取得了突破进展，仪器性能日趋完善，其应用领域也得到不断的扩展。在环境监测中，尤其是快速和大量的筛查时，首要解决的问题是污染物浓度是否超标或者是否存在污染的问题。对于大多数的一次性传感器，它们都不利于进行定量分析前标定曲线，而可再生传感器则可以弥补一次性传感器的不足。在定量分析前，需要对标准曲线进行校正，且在测量不同浓度的标准样品时，传感器表面的性质应尽可能保持基本一致。如果能在同一块传感器基底表面上进行再生，一方面可使标准曲线校正结果更为可靠，另一方面则可使整个分析过程利于实现自动化和简单化操作。在环境监测中，监测的对象包括水(江、河、湖、海及地下水)、固体废物、空气、土壤和生物等客体，只有对这些客体进行综合分析，才能准确地描述和评价环境质量状况。以下就SPR传感器在水质、农药残留以及有毒气体的监测应用进行概述。

3.1 表面等离子共振技术在水质监测中的应用

随着水资源的不合理开发以及水污染问题的不断加重，在一些城市的饮用水中甚至可检测出30多种对人体有害的微生物、致癌物或重金属离子，这些微生物就包括沙门氏菌、大肠杆菌、杆状细菌以及枯草杆菌等。Koubova等^[16]报道了沙门氏菌和革兰氏阳性菌的SPR检测方法。葛晶等^[17]报道了使用SPR生物传感器快速检测大肠杆菌的方法，将对大肠杆菌的检测限由10⁹ cfu/L下降到10⁸ cfu/L。(10⁶ cfu ml^-1下降到10⁵ cfu ml^-1. 每ml菌落形成数，cfu 菌落形成单位.)Forzani等^[18]用SPR技术检测了地下水中的As₂O₃的含量，其检测限可小于10ppm。Soonwoo等^[19]建立起一种选择性测定水体中的Hg²⁺离子的SPR方法，采用1,6-二硫醇在金表面构成自组装膜芯片，在含有汞离子的水样中，汞离子与芯片作用产生信号，在浓度为0.001~1.0mmol/L的范围内具有线性关系，如图3所示，且其他离子如Pb²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺和Cu²⁺离子不产生干扰。May等^[20]通过Cd²⁺离子对尿素酶的抑制将尿素酶修饰组装在金膜表面，可以测定水样中的镉离子浓度，其线性范围在0~0.01μg/L。因此部分指标可以直接用于地表水质标准检测，如果指标低于标准要求时，则需要制样了。

图3 Hg²⁺离子浓度与SPR传感器芯片信号的关系

3.2 表面等离子共振技术在农药残留检测上的应用

蔬菜瓜果中的农药，特别是脂溶性农药残留若进入人体后，可积累或贮存在人体组织和器官内，长期食用会引发急性中毒事件。目前，关于SPR传感器在农药或杀虫剂上的分析和检测已经有较多的报道。Chinowsky等^[21]报道了一种便携式的毒素快速鉴定表面等离子仪，该装置能够同时检测6种或6种以上的毒素。Revoltellal等^[22]对比了酶联免疫技术、放射免疫技术和SPR技术检测农药C₈H₆C₁₂O₃（2, 4D）的特点，发现SPR技术的检测范围在0.001~1.0mg/L，更适合于现场检测。Mauriz等^[23]报道了能够同时检测两到三种农药的SPR免疫传感器阵列，其检测限均在几十个ppt的级别。Harris等^[24]则报道了一种用于测定水环境中除草剂的SPR传感器方法，当利用抗西玛津IgG抗体时其检测限可达0.12μg/L，测定一个样品的时间为20分钟。根据国家标准GB/T 5009.199-2003《蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测》和行业标准NY/448-2001《蔬菜上有机磷和氨基甲酸酯类农药残留快速检测方法》，酶抑制法对敌敌畏的检出限值与SPR法相比偏高(为0.1mg/L)。

比如，湖南农业大学对建立了四种SPR检测除草剂莠去津的新方法，分别是：利用氨基团置换莠去津的氯基团，SPR竞争检测莠去津（改良竞争法）；利用金纳米粒子增强SPR灵敏度直接检测莠去津；利用磁纳米粒子增强SPR灵敏度直接检测莠去津；利用磁纳米粒子增强SPR灵敏度，结合改良竞争法检测莠去津。上述四种方法的最低检测浓度依次为：10pg/mL、2pg/ml、2 pg/ml和0.5 pg/ml。远低于国家标准（0.05mg/kg）

3.3 表面等离子共振技术在有毒气体检测上的应用

采用SPR技术检测的气体包括：常见的易燃易爆和有毒气体、有机气体和蒸气等，包括NO₂、H₂S以及NH₃等。SPR技术用于气体检测的关键技术在于敏感膜材料的选择和优化。此外，仪器结构的设计和制膜方法等也会对检测结构有显著的影响。

Zhu^[25]和Lloyd ^[26]采用Kretchmann棱镜型SPR装置和He/Ne激光器作为光源，分别研究了以酞菁硅(SiPc)和酞菁铜(CuPc)为主的超薄膜(LB膜)作为敏感膜检测NO₂气体的响应情况，其中，由于NO₂与Ag基底的相互作用导致SiPc检测共振角的不可逆偏移，而在Ag表面覆盖一层起保护作用的Ni，阻断Ag与NO₂之间接触的可能性，则可消除SPR图谱上由于NO₂与Ag基底相互作用导致共振角的不可逆偏移。Vukusic等^[27]采用相同的SPR装置，以酞菁钴(CoPc)作为敏感膜材料来检测NO₂气体，其检出限为100 ppm，响应时间为几分钟，此外，将敏感膜于75℃的炉中烘烤24h，发现CoPc的恢复过程很慢，难以进行可再生。Rella等^[28]以溶胶凝胶法制备掺杂金属酞菁(TiO₂+CuPc、TiO₂+PdPc、TiO₂+FePc)的TiO₂多孔膜进行检测，实现NO₂的检出限为ppm。Wright等^[29]报道了采用Kretschmann棱镜型SPR传感器，以聚苯胺分子为主的LB膜作为敏感膜，用于检测H₂S气体。

NH₃为碱性气体，其检测通常采用溴甲酚紫(BCP)等指示剂作为敏感膜材料，而金属氧化物因其较好的重现性和表面性质也可用于NH₃的检测。Vangent等^[30]采用Kretschmann棱镜型SPR传感器，以BCP作为敏感膜，检出NH₃的分辨率为5%，响应时间小于1min，可逆性好，其中，NH₃与BCP之间的反应为：

BCP+NH₃+H₂O→BCPOH^-+NH₄⁺

其他可引起溶液pH值改变的气体如CO₂、SO₂和H₂S等也可与BCP发生反应，当这些气体吸附在BCP表面时，将引起BCP折射率的改变，从而导致SPR图谱上共振角的位移，因此BCP作为敏感膜的选择性不好。Challener等^[31]开发出转盘式SPR传感器，以BCP作为敏感膜，硅光电二极管作为检测器，将检出NH₃的极限提高至10 ppb。Nanto等^[32]以丙烯酸作为敏感膜材料，用于检测NH₃和胺类等有害气体的检测，其中，NH₃的检测限为ppm级。Gu等^[33]以溶胶凝胶法制备的Ag-SiO₂-SnO₂和Ag-Sn₂金属氧化物薄膜作为敏感层，制作出Kretschmann棱镜型SPR传感器，用于检测NH₃、C₃H₈和C₂H₅OH等3种气体的检测，其检出限均为100 ppb。

4 结语和展望

目前，SPR技术亟待解决的主要问题在于，如何提高SPR传感器的性能和芯片质量，降低芯片制作成本，以及探索适宜的结合反应条件。当前SPR技术的发展重点集中在：(1)改进基底材料的表面处理技术和寻找合适的缓冲体系，提高结合反应效率和减少非特异性结合；(2)建立高效和快速的芯片活化方法，制备出多功能的检测芯片，并能够保持芯片表面物质的稳定性和生物活性；（3）进一步推广应用需要标准样品体系建立，便于比对与校准；(4)开发出功能更加完善、灵敏度和分辨率更高的仪器和检测方法，通过优化系统结构和数据处理方法，继续扩大SPR传感器潜在的应用领域。该类新型检测技术综合，不仅仅是科学研究问题，其发展还需要环保、计量、标准化等事业技术部门的协作与支持。

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注：文章初稿由马国欣、邱胜宝，向鹏，邬纪泽等共同完成。

作者：中国真空学会常务理事，广东省计量测试学会常务理事